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提升Surfactin产量的定向改造技术

放大字体  缩小字体 发布日期:2018-12-09  浏览次数:512
核心提示:提升Surfactin产量的定向改造技术

2 提升Surfactin产量的定向改造技术

从各种环境中分离的产surfactin野生菌株的产量通常在100–600mg/L;部分高产突变菌株或培养基优化后的菌株发酵水平在1000mg/L左右;此后,仅通过诱变育种或发酵优化的传统策略已经难以获得产量的大幅突破。

在提升surfactin产量的菌株改造方面,针对NRPS功能基因srfA的启动子改造和强化surfactin外排分泌途径的改造策略,获得了较好的成果,对surfactin产量的提升效果达到了3–10倍。

2.1 NRPS功能基因srfA的启动子改造

SrfA是surfactin合成的功能基因,是一个长达26.2 kb大小的基因簇,因此,通过过表达该基因来强化surfactin的合成途径在技术上存在较大难度。该功能基因受到启动子PsrfA的调控,而启动子的强弱可以在一定程度上决定菌株的生产能力,因此,启动子替换被认为是提高原始菌株产脂肽的合理手段。

启动子改造促进产量提升的典型成功案例来自于对天然高产菌株的改造结果。Sun等通过同源重组的方法将B. subtilis fmbR中的启动子PsrfA替换成一个来源于B. subtilis的强诱导型启动子Pspac,得到了重组菌株fmbR-1;在IPTG (300μmol/L)诱导下重组菌株fmbR-1的产量是野生型出发菌株的10倍,产量达到3.86g/L;在无IPTG添加条件下,fmbR-1的产量也可以高达5倍左右。除了替换一些天然强启动子外,还可以替换一些人工合成的启动子。清华大学于慧敏课题组在surfactin的启动子改造方面也获得了显著成果。Song等分析了surfactin高产野生菌株B. subtilis THY-7的转录组数据,发现该菌株控制surfactin合成的原始启动子PsfrA是一个弱启动子,同时也发现了菌株自身的一些强启动子(PgroE、PsacB、PsacP);令人惊讶的是用强启动子PgroE替换原始启动子PsfrA后,重组菌株不能合成surfactin;随后人工构建了3个杂合型强启动子Pg1、Pg2和Pg3用于改造B. subtilis THY-7菌株。

杂合型启动子Pg1融合了启动子PgroE的–35到–10序列和PsacB的RAT诱导元件序列,重组菌株THY-7/Pg1的产量达到了1.44g/L。杂合型启动子Pg2是在Pg1的基础上,在PgroE的–35到–10序列中间融合了一段lacO操纵子序列,重组菌株THY-7/Pg2的产量为5.98g/L。杂合型启动子Pg3是根据枯草芽胞杆菌的sigma因子70(σA)的–35到–10的保守序列以及点突变Pg2的2个碱基的基础上设计而来的,最终重组菌株THY-7/Pg3在5L发酵罐上(具有泡沫回收装置)发酵32h的产量达到了9.74g/L,表明改造后的菌株具有高产、高生产速率等优良性状。该重组菌株的surfactin产量也是目前报道的最高产量。

但是,在模式菌株或其他菌株中也存在启动子改造的失败案例。Coutte等用组成型启动子PrepU替换了B. subtilis 168衍生菌株BBG111的PsrfA后,得到突变菌株BBG113的surfactin产量却有所下降。随后Wilenbacher等的研究发现,用一个强的组成型启动子Pveg分别替换产surfactin能力弱的菌株3A3B和产surfactin能力强的DSM 10T的原始启动子PsrfA,产生重组菌JWSurf2和JWSurf3;结果发现重组菌JWSurf2的surfactin产量高于原始菌3A3B,而JWSurf3的产量却远低于原始菌DSM 10T。

由此我们可知,通过定向改造产surfatin菌株的启动子PsrfA并不都会导致surfactin产量的提高,这可能与菌株自身产surfactin能力的强弱以及菌株特性有关。对野生型surfactin生产菌株进行启动子改造前,有必要对菌株的转录组进行分析,有针对性地改造或构建适合该菌株的强启动子或杂合启动子,有助于提高成功率。同时,也要考虑到野生芽胞杆菌的遗传操作系统存在很多不确定性,大大增加了分子改造的难度;选择和构建合适的遗传操作方法是成功的基础。

2.2 Surfactin外排分泌途径的改造

目前,surfactin是如何通过细胞膜排出体外的并不是十分清楚。脂肽特别是surfactin可以增加生物膜的透性和解离程度,使生物膜结构失去稳定性。据文献报道surfactin的浓度对细胞膜的影响十分关键,surfactin的外排可能就是跨膜运输的结果;跨膜运输按所用能量不同,可以分为两类:一类是依赖于ATP,另一类是依靠质子动力(proton motive force,PMF)。

Surfactin的分泌受到一些外排蛋白的影响。Tsuge等报道了枯草芽胞杆菌中的跨膜蛋白编码基因yerP可以编码与RNDRND(抗性,结瘤和细胞分裂)家族外排泵同源的依赖于PMF的跨膜蛋白;该基因有助于枯草芽胞杆菌抵御surfactin对自身细胞的伤害,与野生型相比,yerP缺失型菌株的surfactin产量大大减少。Xu等报道B. subtilis THY-7野生菌中surfactin的外排模式主要依赖于质子动力(PMF),而THY-7菌株中的跨膜蛋白基因ycxA由于移码突变造成功能丧失,不能转运surfactin。因此,他们在THY-7菌株中分别表达了3个PMF驱动的跨膜蛋白编码基因ycxA、krsE和yerP,结果发现与THY-7菌株相比,强化surfactin外排途径的重组菌株产量分别提高了89%、52%和145%。对于菌株的外排系统的改造,首先要知道该菌株外排的方式以及外排性能的优劣,通过强化表达的方式来增加细胞中参与surfactin外排的跨膜蛋白,对于这些外排蛋白是如何促进surfactin流通的机理仍需进一步的研究。

2.3 改造srfA的转录调控基因

Surfactin的合成需要功能基因簇srfA的转录表达;但是特别之处在于,基因簇srfA中(srfAB)还包含了感受态调控基因comS,使得功能基因srfA的转录水平受到信息素ComX和感受态刺激因子Phr的调控。人们推测surfactin与细胞感受态之间的关联性,可能在于surfactin改变膜结构有助于吸收外源DNA片段。

B. subtilis编码了8个Phr感受态刺激因子(PhrA、PhrC、PhrE、PhrF、PhrG、PhrH、PhrI和PhrK)和11个天冬氨酰磷酸酯磷酸酶蛋白(RapA到RapK)。Phr刺激因子可以抑制对srfA负调控的Rap蛋白(RapC,RapF和RapK)的活性。ComX与膜结合的组氨酸激酶ComP相互作用,其在受到刺激后自磷酸化,然后将其磷酸基团转移到调控蛋白ComA中的丝氨酸残基,磷酸化的ComA与srfA的启动子区域结合,激活RNA聚合酶的活力,使srfA开始转录。因此,B. subtilis通过信息素和刺激因子ComX和PhrC基于细胞群体感应机制(quorum sensing,QS)调控surfactin合成。Jung等在B. subtilis中过表达comX和phrC基因,得到重组菌B. subtilis(pHT43-comXphrC)的surfactin产量大幅提高,是对照菌株的6.7倍。Wang等突变了B. subtilis的ComX反应调节受体基序中的3个非天冬氨酸残基,结果使surfactin的合成能力大大下降。

细胞群体感应贯穿了surfactin合成的整个过程,ComX似乎是提高surfactin生产能力的一个关键因素,然而,对于该基因调控网络的研究并不多。目前,有关QS调控基因与surfactin合成能力的研究中所使用菌株的生产能力普遍较低,我们还无法了解在高产菌株中这些QS调控基因及其调控方式是否有改变。

 
 
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